DIY

自宅でPCR検査(電気泳動編)

自宅でPCR検査(DNA抽出、PCR反応編)”に引き続いて、電気泳動を行います。”Dr. ジーン9 アガロースゲル電気泳動セット”の使用を前提に進めていきます。

準備物

今回は、高校など使用することを前提に作られた教育用のキットを使用します。以下に必要な備品をリストアップします。

道具

  • マイクロピペット(5μl)
  • マイクロピペット用チップ
  • 廃棄チップ入れ
  • 5L以上の容器
  • メスシリンダー
  • スターラー
  • 染色用容器(トレー、タッパー)
  • 薬包紙
  • 500mL三角フラスコ
  • ラップ
  • 軍手

試薬

  • 消毒用エタノール(70%程度)
  • Dr. ジーン9 アガロースゲル電気泳動セット

装置

  • 電気泳動装置(自作)
  • はかり

参考にしたリンク

  1. 岩手県総合教育センター資料
  2. Dr. ジーン7 植物多型解析PCRキット「取扱説明書」
  3. Dr. ジーン9 アガロースゲル電気泳動セット「取扱説明書」

実験方法

電気泳動バッファー(1×TAE)の調製

1.500ml以上の容器を準備し、キット構成品の 50×TAE(50 ml)を容器に全量入れて、水を 4,90ml 加える。
2.よく撹拌する。
3.耐熱タッパーにアガロースを1.5gに1×TAEを100ml加えて撹拌する。
1×TAEは氷上で冷やしておくとアガロースゲルが分散しやすくなる。
4.耐熱タッパーにラップを掛けて、爪楊枝で蒸気抜きの穴をあける。
5.電子レンジで5分間加熱。突沸を防ぐために、加熱と撹拌を繰り返す。
6.加熱後は室温で撹拌しながら気泡を取り除く。
7.重量を量り、蒸発した水分を補うために、温めた水を加える。
8.コームを差し込んで、冷却する。冷却中はラップを掛けて水分の蒸発を防ぐ。

染色液(CLEAR STAIN Blue)の調製

電気泳動後のゲルを染色するための溶液を調製します。

1.染色液用容器に 1×TAEを180ml添加し、染色試薬 CLEAR STAINE Blueを20ml入れる。

アガロースゲル電気泳動

1.1×TAEwp泳動槽に適量注ぐ。
2.試料の入ったマイクロチューブにローディングバッファーを5μl加えて、ピペッティングを行い混和する。
ローディングバッファーの役割は2つある。①ウェル内に試料が沈み易くすることで、試料の拡散を防ぐ。ローディングバッファーには重しの役割をする比重の重い成分が含まれおり、ローディングバッファーの添加によりサンプルである DNA の比重が重くなる。②ローディングバッファーには色素が添加されており、DNA サンプルがどこまで流れているか予想することができる。
3.マーカーDNAを5 µl、サンプルを各 10μl ずつゲルのウェルに入れる。
4.電源を入れて電気泳動を開始する。100Vで30~40分程度泳動する。

染色・脱色

1.電気泳動を止める。オレンジ色の色素がゲルの末端(+極側)から 2 cm 程度まできたら、泳動を止め、ゲルをゲルトレイからはずし、染色用容器(タッパーなど)に入れる。
2.ゲルを10分間染色する。ゲルの入った容器に染色液をゲルが浸る程度まで加え、10 分間染色する。
3.ゲルを15分程度脱色する。染色後、染色液を別の容器に捨て、ゲルを 60℃以下のお湯につけ脱色する。15分後あたりから、目視で確認が可能になる。
4.ゲルを写真で撮影する。